体外消炎痛抑制多发性骨髓瘤细胞增殖及其机制研究
作者：李娟 罗绍凯 彭爱华 孔庆榆
单位：李娟 罗绍凯 彭爱华 孔庆榆(中山医科大学附属第一医院血液内科 广州 510080)
关键词：消炎药；多发性骨髓瘤；IL-6；IL-6R；细胞分离
肿瘤000622
中图分类号：R733.3 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0457-02
消炎痛(Indomethacin, IN)是一种临床常用的非甾体类抗炎药，近年来研究发现，IN具有抑制结肠癌、白血病等肿瘤细胞的增殖作用[1，2]，具有较广谱的抗肿瘤效应。本研究观察了在不同浓度的IN作用下，对多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)细胞株和MM患者瘤细胞体外增殖的影响，确定IN是否有抗骨髓瘤细胞的增殖作用，并通过测定瘤细胞自分泌的IL-6及瘤细胞表面IL-6受体的变化，探讨IN对骨髓瘤细胞的作用机制。
, 百拇医药
材料与方法
一、试剂 IN、二甲亚砜(DM30)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)分别为Sigma公司、瑞士Flnka公司产品，IN溶解于DM30中。
二、标本来源与细胞培养 小鼠MM细胞株SP2/0为本室冷冻复苏传代培养，实验取对数期生长的细胞，用RPMI 1640培养液洗3次备用。人多发性骨髓瘤细胞来自本院门诊或住院的骨髓涂片，骨髓瘤细胞占20%以上的MM患者20例，每例抽取骨髓10 ml，Ficoll 液离心取骨髓瘤细胞，RPMI 1640洗3次备用，在小鼠MM细胞株及人骨髓瘤细胞中分别加入浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mmol/L的IN，细胞终浓度为105/ml，在5% CO2、100%湿度及37℃的细胞培养箱中培养72 h，收集部分细胞及培养液备用，不含IN的为阴性对照组，实验组和对照组均作3个复孔。
三、细胞增殖抑制试验 采用MTT法，每孔加MTT液10 μl，培养4 h后用MTT终止液终止反应，570 nm波长处测定各孔OD值，按下面公式计算细胞抑制率：细胞抑制率(%)=(1-实验孔OD值/对照组OD值)×100%。
, 百拇医药
四、IL-6生物学活性检测 用IL-6依赖性细胞株对与IN共同温育72 h的瘤细胞培养液进行IL-6生物学活性测定，不含IN的瘤细胞培养液作对照。
五、流式细胞仪分析 分别将小鼠和患者的抗IL-6受体单克隆抗体加入培养前后的细胞中，4 ℃放置1 h，洗3次后加入FITC标记的第二抗体，流式细胞仪抑制瘤细胞表面的IL-6受体。
结 果
一、不同浓度的IN对小鼠和人骨髓瘤细胞增殖的抑制作用 不同浓度的IN对小鼠和人骨髓瘤细胞增殖的抑制作用，IN浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mmol/L时对小鼠SP2/0抑制率分别为10.0%、13.0%、17.1%、25.2%、33.3%、39.1%、52.0%、66.1%、70.2%、74.5%，在相同的IN浓度下对人骨髓细胞抑制率分别为12.2%、14.9%、19%、29%、35%、41%、50%、62%、71%、78%。IN对小鼠和人的骨髓瘤细胞的抑制呈浓度依赖效应(见附图)。
, 百拇医药
附图 不同浓度IN对小鼠SP2/0细胞和人骨髓瘤细胞增殖的抑制作用
二、IN对SP2/0和人骨髓瘤细胞自分泌IL-6活性的影响
选择IN浓度为7 mmol/L组培养后小鼠细胞株SP2/0和MM患者瘤细胞培养液中IL-6活性及细胞表面IL-6R表达进行检测(见表1)。
表1 IN 7 mmol/L对小鼠SP2/0和人骨髓瘤细胞表达的影响(
±s)
人骨髓瘤细胞IN组
人骨髓瘤细胞无IN组
SP2/0 IN组
SP2/0无IN组
, 百拇医药
IL-6(ng/L)
210.6±139.4
560.8±303.5
138.5±57.6
610.7±395.5
IL-6R阳性细胞(%)
15.3△△
30.8
21.5△
48.2
注：分别与无IN组比较P均<0.001，△，P<0.05；△△P<0.01
, http://www.100md.com
讨 论
近年来有关非甾体类药(NSACDs)体外抗肿瘤生长的活性已引起人们的关注，特别在消化系统肿瘤方面已有文献报道[1，3]，1998年Bellosillo等[2]也报道了阿斯匹林水杨酸钠对慢性淋巴细胞白血病细胞的体外生长有抑制作用，并认为这种抑制作用是通过促使细胞凋亡来实现的。作者观察了体外IN对血液系统常见恶性肿瘤之一的MM瘤细胞生长的影响，结果表明IN对小鼠来源的SP2/0细胞株和患者骨髓瘤细胞的生长有明显的抑制作用，这种抑制作用呈剂量依赖关系。当IN浓度从1 mmol/L逐渐增加到10 mmol/L时，IN对骨髓瘤细胞生长的抑制作用逐渐加强，当IN浓度为7 mmol/L时，IN对骨髓瘤细胞的生长抑制作用达50 %和52 %。IN对骨髓瘤生长的抑制作用是通过何种机制?已知IL-6是MM的关键性生长因子[4]，IL-6与IL-6R表达水平与MM瘤细胞生长呈正相关关系，作者选择对骨髓瘤细胞生长有50 %抑制作用的IN浓度为7 mmol/L组与阴性对照组进行了IL-6活性和IL-6R表达的比较，结果是当IN浓度为7 mmol/L时，骨髓瘤细胞的IL-6活性及IL-6R表达均明显下降，提示IN对骨髓瘤细胞的体外生长抑制作用是通过抑制瘤细胞IL-6的自分泌和下调IL-6R的表达来共同实现的。
, 百拇医药
李 娟，女，医学博士，副教授，硕士导师
参考文献
[1]Shiff ST, Koutsos MT, Qiao L, et al. Nonsteroidal antiinflammatory drug inhibit the proliferation of colon adenocarcinoma cells effect s on cell cycle and apoptosis〔J〕. Exp Cell Res,1996,272:176
[2]Bollosillo B, Pique M, Barragan M, et al. Aspirin and salicylate induce apoptosis and activation of caspases in B-cell chronic lymphocytic leukemia cell〔J〕. Blood,1998,92:1406
, 百拇医药
[3]Elder DJE, Hague A,Hicks DJ, et al. Differential growth inhibition by the aspirin metabolite salicylate in human colorectal tumor cell lines:enhanced apoptosis in carcinoma and in vitro-transformed adenoma relative to adenoma cell lines〔J〕. Cancer Res,1996,56:2273
[4]Urashima M, Ogata A, Chanhan D, e al. Interleukin-6 promotes multiplemyeloma cell growth via phosphorylation of retinoblastoma protein〔J〕. Blood,1996,86:2219
(收稿日期：2000-05-19), 百拇医药
单位：李娟 罗绍凯 彭爱华 孔庆榆(中山医科大学附属第一医院血液内科 广州 510080)
关键词：消炎药；多发性骨髓瘤；IL-6；IL-6R；细胞分离
肿瘤000622
中图分类号：R733.3 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0457-02
消炎痛(Indomethacin, IN)是一种临床常用的非甾体类抗炎药，近年来研究发现，IN具有抑制结肠癌、白血病等肿瘤细胞的增殖作用[1，2]，具有较广谱的抗肿瘤效应。本研究观察了在不同浓度的IN作用下，对多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)细胞株和MM患者瘤细胞体外增殖的影响，确定IN是否有抗骨髓瘤细胞的增殖作用，并通过测定瘤细胞自分泌的IL-6及瘤细胞表面IL-6受体的变化，探讨IN对骨髓瘤细胞的作用机制。
, 百拇医药
材料与方法
一、试剂 IN、二甲亚砜(DM30)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)分别为Sigma公司、瑞士Flnka公司产品，IN溶解于DM30中。
二、标本来源与细胞培养 小鼠MM细胞株SP2/0为本室冷冻复苏传代培养，实验取对数期生长的细胞，用RPMI 1640培养液洗3次备用。人多发性骨髓瘤细胞来自本院门诊或住院的骨髓涂片，骨髓瘤细胞占20%以上的MM患者20例，每例抽取骨髓10 ml，Ficoll 液离心取骨髓瘤细胞，RPMI 1640洗3次备用，在小鼠MM细胞株及人骨髓瘤细胞中分别加入浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mmol/L的IN，细胞终浓度为105/ml，在5% CO2、100%湿度及37℃的细胞培养箱中培养72 h，收集部分细胞及培养液备用，不含IN的为阴性对照组，实验组和对照组均作3个复孔。
三、细胞增殖抑制试验 采用MTT法，每孔加MTT液10 μl，培养4 h后用MTT终止液终止反应，570 nm波长处测定各孔OD值，按下面公式计算细胞抑制率：细胞抑制率(%)=(1-实验孔OD值/对照组OD值)×100%。
, 百拇医药
四、IL-6生物学活性检测 用IL-6依赖性细胞株对与IN共同温育72 h的瘤细胞培养液进行IL-6生物学活性测定，不含IN的瘤细胞培养液作对照。
五、流式细胞仪分析 分别将小鼠和患者的抗IL-6受体单克隆抗体加入培养前后的细胞中，4 ℃放置1 h，洗3次后加入FITC标记的第二抗体，流式细胞仪抑制瘤细胞表面的IL-6受体。
结 果
一、不同浓度的IN对小鼠和人骨髓瘤细胞增殖的抑制作用 不同浓度的IN对小鼠和人骨髓瘤细胞增殖的抑制作用，IN浓度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mmol/L时对小鼠SP2/0抑制率分别为10.0%、13.0%、17.1%、25.2%、33.3%、39.1%、52.0%、66.1%、70.2%、74.5%，在相同的IN浓度下对人骨髓细胞抑制率分别为12.2%、14.9%、19%、29%、35%、41%、50%、62%、71%、78%。IN对小鼠和人的骨髓瘤细胞的抑制呈浓度依赖效应(见附图)。
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附图 不同浓度IN对小鼠SP2/0细胞和人骨髓瘤细胞增殖的抑制作用
二、IN对SP2/0和人骨髓瘤细胞自分泌IL-6活性的影响
选择IN浓度为7 mmol/L组培养后小鼠细胞株SP2/0和MM患者瘤细胞培养液中IL-6活性及细胞表面IL-6R表达进行检测(见表1)。
表1 IN 7 mmol/L对小鼠SP2/0和人骨髓瘤细胞表达的影响(
±s)人骨髓瘤细胞IN组
人骨髓瘤细胞无IN组
SP2/0 IN组
SP2/0无IN组
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IL-6(ng/L)
210.6±139.4
560.8±303.5
138.5±57.6
610.7±395.5
IL-6R阳性细胞(%)
15.3△△
30.8
21.5△
48.2
注：分别与无IN组比较P均<0.001，△，P<0.05；△△P<0.01
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讨 论
近年来有关非甾体类药(NSACDs)体外抗肿瘤生长的活性已引起人们的关注，特别在消化系统肿瘤方面已有文献报道[1，3]，1998年Bellosillo等[2]也报道了阿斯匹林水杨酸钠对慢性淋巴细胞白血病细胞的体外生长有抑制作用，并认为这种抑制作用是通过促使细胞凋亡来实现的。作者观察了体外IN对血液系统常见恶性肿瘤之一的MM瘤细胞生长的影响，结果表明IN对小鼠来源的SP2/0细胞株和患者骨髓瘤细胞的生长有明显的抑制作用，这种抑制作用呈剂量依赖关系。当IN浓度从1 mmol/L逐渐增加到10 mmol/L时，IN对骨髓瘤细胞生长的抑制作用逐渐加强，当IN浓度为7 mmol/L时，IN对骨髓瘤细胞的生长抑制作用达50 %和52 %。IN对骨髓瘤生长的抑制作用是通过何种机制?已知IL-6是MM的关键性生长因子[4]，IL-6与IL-6R表达水平与MM瘤细胞生长呈正相关关系，作者选择对骨髓瘤细胞生长有50 %抑制作用的IN浓度为7 mmol/L组与阴性对照组进行了IL-6活性和IL-6R表达的比较，结果是当IN浓度为7 mmol/L时，骨髓瘤细胞的IL-6活性及IL-6R表达均明显下降，提示IN对骨髓瘤细胞的体外生长抑制作用是通过抑制瘤细胞IL-6的自分泌和下调IL-6R的表达来共同实现的。
, 百拇医药
李 娟，女，医学博士，副教授，硕士导师
参考文献
[1]Shiff ST, Koutsos MT, Qiao L, et al. Nonsteroidal antiinflammatory drug inhibit the proliferation of colon adenocarcinoma cells effect s on cell cycle and apoptosis〔J〕. Exp Cell Res,1996,272:176
[2]Bollosillo B, Pique M, Barragan M, et al. Aspirin and salicylate induce apoptosis and activation of caspases in B-cell chronic lymphocytic leukemia cell〔J〕. Blood,1998,92:1406
, 百拇医药
[3]Elder DJE, Hague A,Hicks DJ, et al. Differential growth inhibition by the aspirin metabolite salicylate in human colorectal tumor cell lines:enhanced apoptosis in carcinoma and in vitro-transformed adenoma relative to adenoma cell lines〔J〕. Cancer Res,1996,56:2273
[4]Urashima M, Ogata A, Chanhan D, e al. Interleukin-6 promotes multiplemyeloma cell growth via phosphorylation of retinoblastoma protein〔J〕. Blood,1996,86:2219
(收稿日期：2000-05-19), 百拇医药